20 Giu Standardizzazione della MRD nelle LAL Ph+ / 2016

Tutor: Dott.ssa Carmen Fava

20 Giugno 2016

Durante la riunione si è discusso:

• Il razionale della standardizzazione:
  • Disomogeneità nella tecnica (strumentazioni, plasmidi, reagenti, geni di controllo, ecc…) e nelle procedure;
  • Disomogeneità nell’espressione del risultato:
    • Copie di Bcr-Abl
    • Rapporto Bcr-Abl/Abl
    • Rapporto Bcr-Abl/Abl in %
    • Riferimenti impropri alle definizioni di deep molecular response dell’IS (vedi LMC)
    • Riduzione logaritmica del trascritto
  • Unmet needs del monitoraggio molecolare nelle LAL Ph+:
    • Valutazione del trascritto all’esordio (considerare l’eventuale utilizzo di GUS come gene di controllo per ottimizzare la valutazione)
    • “Importazione” dalla LMC di concetti come il raggiungimento dell’MMR che erano stati estrapolati in termini di riduzione di 3 log dall’esordio (con assunto di malattia all’esordio pari al 100%) dall’analisi dello studio IRIS in cui la threshold che correlava con un significato prognostico favorevole era lo 0.1%
    • Diversi time-point di valutazione a seconda dei diversi protocolli
    • Aumento della sensibilità della metodica
    • Confrontabilità tra i dati provenienti da diversi laboratori
    • Significato “clinico” di oscillazioni di bassi livelli di trascritto
  • Posizione del gruppo di lavoro italiano rispetto al gruppo di lavoro europeo: partecipano al gruppo di lavoro europeo i centri di:
    • Monza
    • Bergamo
    • Roma
    • Napoli
    • Orbassano
    • Bologna
  • Criticità del gruppo di lavoro europeo:
    • Lentezza delle procedure
    • Già effettuati diversi round di controlli di qualità senza trarne molte conclusioni
    • Difficoltà dell’interazione con il coordinatore
  • Tuttavia nel gruppo europeo sono già state discusse degli aspetti importanti ed esistono già delle indicazioni preliminari su:
    • Diluizioni plasmidiche (criticità sulle 10 copie; proposte le 20 e le 50)
    • Tipo di enzima di retrotrascrizione
    • Criteri per accettare come valida un’analisi [numero di copie di ABL: 1000-10000 accettato come valido (?); differenza in termini di 1,5 ct tra i replicati del campione analizzato (da verificare); distanza di 4 ct tra i vari punti della curva standard (a livello teorico 1 log di differenza=3,34 ct)]
    • Plasmide unico contenente BCR-ABL1 p190, GUS e Abl
    • Linee cellulari SupB15 in Nalm 6 a diverse diluizioni per i controlli di qualità annuali
  • Proposte di lavoro per il nostro gruppo a breve termine:
    • La Dott.ssa Fava contatterà il Prof. Cazzaniga di Monza per proporgli di far parte di quasto gruppo di lavoro;
    • La Dott.ssa Elia preparerà dei pool di RNA corrispondenti a numeri di copie scalari di Bcr-Abl (esordio, trascritto tra 1 e 10 %, trascritto ≤ 0,1%) e li distribuirà ai laboratori di Monza (previo contatto con il Prof. Cazzaniga), Bergamo, Roma, Napoli, Orbassano, Bologna, e Bari;
    • Il Dott. Gottardi distribuirà i form per il confronto di apparecchiature e metodi tra i diversi laboratori;
  • Proposte di lavoro a medio termine:
    • Bioclarma coltiverà delle cellule SupB15 in Nalm 6 a diverse diluizioni per la produzione di “materiale primario” di cui ogni laboratorio riceverà batches a diverse diluizioni per l’estrazione dell’RNA di riferimento che ci servirà per l’allineamento tra i nostri laboratori. Il tempo previsto per la produzione del materiale è circa 2 mesi da quando saranno reperite le linee cellulari;
    • Per gli esperimenti useremo, se possibile, lo stesso plasmide unico usato dal gruppo europeo. Ne faremo richiesta alla Dott.ssa Pfeifer, responsabile del gruppo europeo;
    • L’RNA di riferimento verrà contemporaneamente quantificato ad Orbassano in droplet digital PCR;
    • I risultati dei vari laboratori verranno confrontati e serviranno (con supporto statistico) a definire il titolo del materiale di riferimento;
    • Verrà eventualmente definito un fattore di conversione per i futuri round di controllo di qualità;
    • Presa visione dei risultati preliminari si discuterà su come esprimere il dato finale dei campioni analizzati;
    • L’obbiettivo successivo sarà implementare la metodica per ottimizzare la sensibilità.
  • Proposte di lavoro a lungo termine:
    • Il significato prognostico dei valori di Bcr-Abl prodotti nel gruppo della standardizzazione verrà testato nell’ambito di protocolli clinici prospettici.