07 Feb Standardizzazione della MRD nelle LAL Ph+ / 2017

Centri partecipanti: Bari, Bergamo, Bologna, Firenze, Monza, Napoli, Orbassano, Palermo , Roma, Siena, Udine

Il lavoro del gruppo standardizzazione BCR-ABL p190 ha come obiettivo uniformare i risultati delle analisi eseguita con metodo RT-qPCR, le regole d’interpretazione dei dati, l’espressione dei risultati e i referti. Obiettivo secondario sarà proporre all’interno del gruppo l’utilizzo di metodiche più innovative come la digitalPCR. Il gruppo lavora in armonia con il gruppo Euro-MRD, di cui molti laboratori sono membri.

Nel primo anno di lavoro abbiamo dimostrato che i laboratori che partecipano al gruppo forniscono risultati piuttosto allineati ma con una variabilità inter-laboratorio del 30-40%, che aumenta per bassi liveli di malattia.

Nel 2017 abbiamo cercato di migliorare e rendere più confrontabili i risultati introducendo un protocollo standard di retro-trascrizione e un enzima suggerito da Roma, la Vilo Superscript IV (Life Technologies), su pool di campioni di RNA corrispondenti a diversi livelli di malattia (1-10%;0.1-0.5%;<0.1%) distribuiti dal centro di Roma nell’autunno 2017. Ciascun laboratorio ha seguito il protocollo di retro-trascrizione indicato sulla scheda tecnica della Vilo Superscript IV. Questa retro-trascrittasi ha consentito a quasi tutti i laboratori di misurare un maggior numero di copie di ABL. Tuttavia l’utilizzo di questo enzima ha causato una maggiore variabilità intra-laboratorio (e quindi una minore riproducibilità) del risultato espresso come rapporto BCR-ABL/ABL e BCR-ABL/GUS rispetto ai risultati ottenuti durante il primo controllo di qualità (QC1), che prevedeva che ogni laboratorio utilizzasse metodiche consolidate nelle diverse strutture. Complessivamente il risultato dell’ultimo QC è stato più scadente e il gruppo ha concordato che modificare le procedure adottate nei singoli laboratori, non è la strategia più rapida verso la standardizzazione, tenuto anche conto di una quota di variabilità associata a differenze non desiderate tra i campioni analizzati (eventualmente imputabili alla degradazione degli stessi, in corso di trasporto o conservazione).

A questo punto, tutti hanno riconosciuto l’utilità della produzione di un “materiale di riferimento” a quantità nota per garantire la confrontabilità e la qualità delle analisi effettuate dai laboratori che quantificano BCR-ABL p190. E’ stata pertanto avviata la produzione del materiale di riferimento da parte del centro di Orbassano che, per questo scopo, si sta servendo dell’azienda Bioclarma. Attualmente sono in coltura cellule Ph positive che esprimono BCR-ABL p190 e cellule Ph negative che serviranno per le diluizioni. Prevediamo che entro Aprile siano pronte tutte 4 diluizioni cellulari seriali e siano completati i controlli di qualità dei
prodotti liofilizzati.

E’ in corso nel gruppo la discussione sul plasmide da utilizzere per le analisi finalizzate alla quantificazioni in  RT-qPCR standard e in digitalPCR del materiale che verrà distribuito a questo scopo a tutti i centri partecipanti al gruppo. Dovremo verificare se è possibile utilizzare lo stesso plasmide usato negli esperimenti nell’ambito del gruppo
Europeo, che contiene BCR-ABL p190, ABL e GUS in una soluzione unica. L’alternativa è fare certificare un plasmide di nostra produzione che diventi parte di un ipotetico Kit da rendere disponibile insieme alle vials di cellule liofilizzate.

Sarà condotta a breve una survey per avere un’idea delle
metodiche digital in uso nei vari laboratori del gruppo CAMPUS standardizzazione p190.
Nel corso dell’anno è stato inoltre affrontato il tema del referto. Innanzitutto abbiamo ripercorso insieme al Dott. Cazzaniga le regole per le interpretazioni dei risultati delle analisi quantitative concordate in ambito Euro-MRD. Le abbiamo condivise, ne abbiamo valutate le criticità e ci siamo esercitati su casi fittizi proposti dal dott. Cazzaniga. Abbiamo verificato che diversi membri del gruppo non hanno fornito la giusta interpretazione dei casi proposti a causa della scarsa chiarezza delle linee-guida e questo ci ha spinto a ripresentare più volte gli esercizi e ha suggerito che in futuro si propongano anche agli altri laboratori al di fuori del gruppo standardizzazione percorsi educazionali che istruiscano e portino al confronto sia sugli aspetti tecnici sia su quelli più teorici. Le definizioni più critiche sono quelle dei casi in cui il trascritto non è valutabile (se negativo con numero di copie insufficienti del gene di controllo) o non quantificabile (se al di fuori dell’intervallo di quantificazione).

Abbiamo poi concordato le informazioni che riteniamo opportuno siano presenti sul referto, proponendo un modello che abbiamo condiviso e utilizzeremo temporaneamente a livello sperimentale nel gruppo standardizzazione, prima di estenderlo a tutto il Campus:

• Num copie assolute p190 (media di 3 pozzetti)
• Num copie ABL (media di 2 replicati)
• Num copie GUS
• Bcr-Abl/Abl % o x10000 (a seconda della tradizione del centro)
• Soglia di quantificazione raggiunto nell’ esperimento: 100 o 10 copie di Bcr-Abl
• Commento in caso di valore positivo non quantificabile o campione non valutabile
• Grafico riassuntivo dei valori dall’esordio (Facoltativo)
• Abbiamo stabilito di non fornire un risultato numerico nel caso in cui il valore ottenuto sia al di sotto della soglia di quantificazione.